Возбудитель мочеполового хламидиоза – Chlamidia trachomatis - микроорганизм, способный размножаться только внутри клетки (чаще всего клетки эпителия мочеполовых органов). Хламидиоз часто характеризуется скрытым и бессимптомным течением, чем и обусловлена частота возникающих на его фоне осложнений.

Долгое время, до создания метода амплификации нуклеиновых кислот, диагностика хламидиоза была затруднена, так как при обычном микроскопическом исследовании возбудитель не виден. Была попытка внедрения цитологического метода с окраской мазка по Романовскому-Гимзе и выявлением специфических внутриклеточных включений.

Но такой метод требовал значительных затрат экономических ресурсов, времени, наличия опытного квалифицированного лаборанта. И это все при низкой информативности данного метода - порядка 10%.

Введение

Более подробно о хламидиях трахоматис (Chlamydia trachomatis) и путях заражения можно узнать в этой статье (перейдите по внутренней ссылке). А здесь мы подробнее остановимся на методах диагностики мочеполового хламидиоза и расшифровке возможных результатов анализов.

Самой первой серологической пробой, внедренной для подтверждения диагноза "урогенитальный хламидиоз", была реакция связывания комплемента (сокращенно РСК). Проба быстро утратила свою актуальность из-за высокой частоты ложноположительных результатов.

На протяжении двух десятков лет одним из самых информативных способов диагностики урогенитального хламидиоза считался метод прямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител. На фоне вышеперечисленных методов он отличался несколько более высокими показателями специфичности и чувствительности. Вместе с тем, метод требовал обеспечения лаборатории дорогостоящим оборудованием и реагентами.

Еще один метод, актуальный и по сей день, – выявление хламидий в культуре клеток. Этот метод будет описан ниже.

Так или иначе, сейчас повсеместно распространен другой анализ на хламидии - исследование отделяемого или соскоба из уретры, влагалища или цервикального канала методом ПЦР.

Согласно Федеральным клиническим рекомендациям, для диагностики мочеполового хламидиоза могут использоваться:

  1. 1ПЦР-диагностика. Федеральными и Европейскими клиническими протоколами для диагностики урогенитального хламидиоза рекомендован метод амплификации ДНК. В отношении первичного выявления инфекции его специфичность равна 100%, чувствительность 98-100% (уровень доказательности А, уровень обоснованности I).
  2. 2NASBA (метод амплификации РНК).
  3. 3Выделение хламидий в культуре клеток.
  4. 4Цитологический метод. Этот метод исследования мазка малоинформативен при диагностике мочеполового хламидиоза (специфичность 10-12%): есть небольшая вероятность обнаружения внутриклеточных включений – так называемых телец Гальбершетдера-Провачека. Помимо этого, при микроскопии проводится подсчет числа лейкоцитов (увеличение их количества - доказательство воспалительного процесса), а также исследование флоры и обнаружение дрожжеподобных грибков.
  5. 5Серологические тесты.
  6. 6Последние три метода (3,4,5) могут применяться только в определенных ситуациях, когда недоступны методы амплификации ДНК и РНК (ПЦР и NASBA).

Анализы на хламидии назначаются:

  1. 1Скрининг  половых инфекций при беременности и предгравидарная подготовка.
  2. 2Желательно ежегодно сдавать анализы женщинам и мужчинам в возрасте до 25 -30 лет, а также лицам, не имеющим постоянных партнеров на протяжении последнего года или недавно сменившим партнера.
  3. 3Лицам, имеющим симптомы уретрита, вагинита, цервицита.
  4. 4Женщинам с ВЗОМТ (сальпингоофорит, эндометрит и так далее).
  5. 5При обнаружении у пациента любой другой половой инфекции.
  6. 6Мужчинам молодого возраста с воспалением придатков яичка и орхитом.
  7. 7При подготовке к внутриматочному вмешательству.
  8. 8При пневмонии и гнойном конъюнктивите у новорожденного.

ПЦР на Chlamydia trachomatis

Суть метода ПЦР - обнаружение генетического материала (ДНК) в исследуемом образце и его достраивание путем добавления «строительного» материала (дезоксинуклеорибофосфатов). В результате цепь ДНК удлиняется, ее обнаружение становится возможным с помощью электрофореза и/или флюоресценции.

Все манипуляции выполняются в специальном приборе – амплификаторе, который самостоятельно контролирует смену температур и протекающих фаз соответственно числу необходимых циклов амплификации.

ПЦР позволяет обнаружить хламидии уже через 3 дня после заражения, при высоком риске исследование повторяют через 2 недели после предполагаемого инфицирования.

В настоящее время набирает большую популярность ПЦР-диагностика в режиме реального времени (у женщин этот тест называется Фемофлор). С его помощью исследуется и качественная, и количественная характеристика влагалищной микрофлоры.

ПЦР в режиме реального времени характеризуется короткими сроками выполнения, высокой специфичностью и чувствительностью (порядка 88-90%).

Но для подтверждения урогенитального хламидиоза ряд авторов рекомендуют использовать монокомпонентные наборы для ПЦР из-за более высокой их чувствительности (100%) в отношении хламидий трахоматис.

Совет этот актуален в ситуации, когда врач подозревает наличие хламидийной инфекции у пациентки, и исследование проводится для верификации диагноза. При отсутствии специфических симптомов у женщины более целесообразно проведение комплексной ПЦР (уровень обоснованности II).

Амплификация РНК хламидий (NASBA)

Это относительно новый для России, но более информативный молекулярно-биологический метод. Суть его заключается в обнаружении в материале (мазке, соскобе, моче и так далее) цепей РНК, наличие которых сопровождает процесс построения и жизнедеятельности клетки хламидии.

РНК является транспортировщиком генетической информации от ДНК и строителем клеточных структур возбудителя путем синтеза белка.

Именно по наличию РНК в положительных результатах NASBA можно судить об эффективности проводимой антибактериальной терапии: оценивается жизнеспособность хламидий. ПЦР, основанная на обнаружении только ДНК, такой возможности не имеет.

NASBA может применяться для контроля излеченности в более ранние сроки по сравнению с ПЦР. Для контроля эффективности лечения данный метод актуален по прошествии всего 14 дней после последнего приема антибиотиков.

Как правильно сдавать анализ на хламидии женщинам?

Женщины анализ на хламидии методами ПЦР или NASBA могут сдать у врача-гинеколога, дерматовенеролога.

Материалами для исследования у женщин обычно служат:

  • Соскоб из уретры, влагалища, цервикального канала вне менструации. Условием является наличие в забранном материале клеток эпителия. При взятии обычного мазка, слизистого отделяемого, гноя и тому подобного, результат может быть не информативным.

Соскоб на анализ у женщин берут из наружного отверстия уретры, цервикального канала и заднего свода влагалища.

  1. 1При использовании универсального зонда: после взятия материала рабочая часть зонда отламывается и погружается в пробирку «Эппендорф» с консервирующим раствором.
  2. 2При использовании ложечки Фолькмана: ее ополаскивают в пробирке с консервирующим раствором. После этого емкость плотно закрывают, а инструмент дезинфицируют и стерилизуют.
  • Первая порция свободно выпущенной мочи. Именно в первой порции мочи сосредоточено максимальное количество слущенных эпителиальных клеток урогенитального тракта. У женщин первая порция свободно выпущенной мочи менее информативна (чувствительность 80-90%), поэтому применяется намного реже, чем соскоб. При этом нет доказательств, что утренняя моча более диагностически значима, чем, например, дневная (уровень обоснованности II).

Моча собирается пациенткой самостоятельно в чистый стерильный сухой контейнер. Для исследования достаточно порядка 10 мл мочи. Рекомендуемый период хранения  - 24 часа при соблюдении необходимого уровня температур (+2С…+8С).

Особенности забора материала у мужчин

Мужчины сдать анализы на хламидии могут у врача-уролога, врача-дерматовенеролога, врача-репродуктолога, андролога.

Материалами для исследования у мужчин обычно служат:

  • Отделяемое из уретры, соскоб из уретры. Подготовка пациента: перед забором материала не мочиться 2-3 часа, при обильных выделениях - 15-30 минут. При наличии обильных патологических выделений (например, гноя) рекомендуется удалить их ватным тампоном.

Процедура взятия соскоба для мужчин достаточно неприятна, порой болезненна. Соскоб забирается универсальным зондом из наружного отверстия уретры. После забора рабочая часть зонда отламывается и погружается в пробирку «Эппендорф» с консервирующей жидкостью.

  • Первая порция свободно выпущенной мочи (чувствительность выше, чем у женщин - 85-95%).
  • По показаниям для анализа на хламидии у мужчин может забираться секрет предстательной железы (при бесплодии, простатите и др. заболеваниях). Подготовка включает половое воздержание в течение 2 дней. Секрет простаты берет квалифицированный специалист после массажа предстательной железы.  Головку полового члена необходимо очистить стерильным ватным тампоном.

После завершения массажа выделившийся сок предстательной железы в количестве 0,5-1 мл собирают в сухую пробирку «Эппендорф» и плотно закрывают. При отсутствии секрета - собирают первую порцию мочи (в ней и будет содержаться весь секрет) по аналогии с обычной вышеописанной техникой.

Максимальный срок хранения всех вышеперечисленных материалов – 24 часа при строгом соблюдении температурного режима в диапазоне +2С…+8С.

Доставляется материал в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами. Для долгосрочного хранения взятый материал необходимо заморозить на срок не более 1 месяца при температуре -20С. Допускается только однократное размораживание материала.

Расшифровка результатов ПЦР и NASBA

  1. 1Как правило, результаты ПЦР и NASBA доступны уже через 24-36 часов, в частных лабораториях сроки готовности результатов удлинены.
  2. 2Результат может быть "положительный" (хламидии обнаружены, то есть у пациента хламидиоз) и "отрицательный" (хламидии не обнаружены, то есть у пациента мочеполового хламидиоза нет или получен ложноотрицательный результат).

При использовании методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) для грамотной интерпретации результатов необходимо соблюдать некоторые условия:

  1. 1Контрольное исследование для оценки эффективности терапии назначается не ранее, чем через 1-1,5 месяцев после окончания приема препаратов (для ПЦР), и не ранее, чем через 14 дней для NASBA. Метод ПЦР не подразумевает определение жизнеспособности обнаруженных микроорганизмов, поэтому необходимо выждать полный цикл смены эпителия.
  2. 2При сборе первой порции мочи после последнего акта мочеиспускания необходим перерыв не менее 3 часов. При обильных патологических выделениях из уретры мочу собирают через 15-20 минут после последнего акта мочеиспускания.
  3. 3Существует мнение, что изменения гормонального фона приводят к появлению в исследуемом материале ингибиторов амплификации (слизь, кровь, гной и другие компоненты). Данная ситуация наиболее актуальна в период беременности, у женщин.

Предлагалось множество способов устранения данной проблемы, но пока ни один из них не является общепризнанным:

  1. 1Ситуация с ингибиторами амплификации актуальна для небеременных женщин на 3 неделе после менструации.
  2. 2При заборе материала в первые дни после менструации есть вероятность ложноотрицательного результата за счет недостаточного накопления возбудителя в эпителии. Таким образом, оптимальный период для взятия соскоба – 4 неделя после менструации.
  3. 3Нет никакой необходимости в специальной подготовке пациентки (например, введения каких-либо препаратов, соблюдения определенной диеты) перед исследованием. На результат это не повлияет.
  4. 4Существует проблема так называемого конкурентного ингибирования. Подобная ситуация возникает при использовании лабораторией наборов для ПЦР-диагностики нескольких видов микроорганизмов. При значительном преобладании в образце какого-либо одного вида возбудителя последний может "замаскировать" наличие других видов микроорганизмов. Результат будет ложноотрицательный.
  5. 5При подозрении на ложноположительный результат возникает необходимость повторного исследования. Эта ситуация актуальна при бессимптомном течении инфекции с низкой бактериальной нагрузкой. В этом случае возможно исследование того же образца, либо забор нового, а также применение другого теста или даже метода исследования (класс рекомендаций В, уровень обоснованности II). При выявлении большого количества хламидий в исходном материале повторное исследование будет лишним и экономически необоснованным.

Иммуноферментный анализ

Согласно последним Федеральным рекомендациям, иммуноферментный анализ (ИФА) не применяется для диагностики неосложненного урогенитального хламидиоза (цервицитов, уретритов и др.). Такое «недоверие» обусловлено тем, что ИФА больше актуален для тяжелых, глубоких поражений хламидиями C. Trachomatis.

Метод ИФА основан на обнаружении в крови специфических антител, вырабатываемых в ответ на антигены хламидий. По сочетанию трех классов иммуноглобулинов в крови пациента можно судить о тяжести и длительности инфекционного процесса.

Как уже было сказано, данный метод при выявлении урогенитального хламидиоза имеет ряд недостатков:

  1. 1Не информативен в диагностике восходящей инфекции, цервицита и уретрита.
  2. 2Высокая частота перекрестных реакций.
  3. 3Высока частота ложноположительных реакций.
  4. 4Не подходит для контроля излеченности после проведенной антибактериальной терапии, так как неизвестно время существования в крови специфических антител;
  5. 5Позволяет диагностировать преимущественно глубокие поражения, например, врожденный хламидиоз у новорожденных (класс рекомендаций А, уровень обоснованности I).

Для проведения ИФА используется венозная кровь пациента, взятая натощак. В защиту данного метода можно отметить:

  1. 1Его более низкую стоимость, по сравнению с ПЦР.
  2. 2Удовлетворительная специфичность порядка 90%.
  3. 3Быстрота выполнения.
  4. 4Простота забора и хранения материала.

Выявление хламидий в культуре клеток (на среде McCoy)

Этот метод уникален тем, что позволяет оценить не только качество проведенной терапии, но и определить чувствительность хламидий к различным группам антибактериальных препаратов.

Суть метода состоит в заражении обработанной культуры клеток забранным материалом с последующим посевом на питательную среду и инкубированием в течение двух суток. Наличие хламидий в полученных клетках определяется методом ПЦР.

Для определения чувствительности к антибиотикам в обработанную культуру клеток вносят ростовую среду с содержанием определенного антибактериального средства и инкубируют в течение 5 суток.

Эффективность препарата определяют по отсутствию или замедлению роста в определенных группах. Наличие роста свидетельствует о резистентности к добавленному в  питательную среду антибиотику.

Недостатки этого метода диагностики - длительность (7 дней) и дороговизна, поэтому в клинической практике он используется в крайне редко. Обычно показанием для его назначения служит длительная неэффективная антибактериальная терапия.

Экспресс-методы

За рубежом в качестве рутинных, недорогих методов выявления хламидийной инфекции используются модифицированные серологические тесты.

Тест-система Chlamidia-antigen ELISA medac

Тест-система работает по принципу твердофазного ИФА-анализа. Готовая тест-система покрыта полученными путем генной инженерии, готовыми специфическими антителами. Данные антитела связаны со специальным ферментным комплексом.

При связывании антигенов с антителами ферменты высвобождаются, появляется желто-зеленое свечение, интенсивность которого и учитывает спектрофотометр.

В отличие от распространенного ИФА, где материалом для исследования служит кровь, при использовании данной тест-системы субстратом служат мазок или соскоб, взятые у женщины, мужчины. Чувствительность этого метода - около 65-70%, а специфичность 90-100%.

РИФ

В основе реакции иммунофлюоресценции (РИФ) лежит прямое связывание антигенов с мечеными антителами, дающими зеленое свечение. Хламидийные тельца подсвечиваются внутри клетки. Результат оценивается при люминисцентной микроскопии.

Чувствительность данного метода - около 50%, что связано с высокой частотой ложных результатов. Это обусловлено и субъективным восприятием результата (исследование проводит лаборант), и высокой вероятностью перекрестных реакций, и нарушением техники забора биологического материала. С помощью данного метода невозможно оценить эффективность проведенного лечения.

На фоне всех недостатков главными плюсами РИФ остаются низкая стоимость, простота выполнения и короткие сроки получения результата. Именно поэтому РИФ еще используют в некоторых странах в качестве рутинного исследования на мочеполовой хламидиоз.