Классификация методов лабораторной диагностики

Диагностика сифилиса имеет некоторые особенности и отличается от диагностики других бактериальных инфекций. Сложное строение и антигенные свойства бледной трепонемы обусловливают ошибки в интерпретации результатов серологических реакций.

Сдать анализ крови на сифилис предлагают 3 основным группам пациентов:

  1. 1Скрининг и диспансеризация групп населения (в том числе и беременность, постановка на учет в женской консультации, поступление на работу и оформление медкнижки и так далее).
  2. 2Скрининг в группах риска (незащищенные половые контакты с человеком, инфицированным сифилисом, лица после принудительных сексуальных контактов, ВИЧ-инфицированные и так далее).
  3. 3Лица, имеющие симптомы заболевания, или лица с подозрением на сифилитическую инфекцию.

Все лабораторные методы условно подразделяют на прямые и непрямые.

Прямые методы

  1. 1Идентификация Treponema pallidum в тёмном поле (темнопольная микроскопия).
  2. 2Заражение подопытных животных (культивирование в лабораторных животных).
  3. 3ПЦР (полимеразно-цепная реакция).
  4. 4ДНК-зонд или гибридизация нуклеиновых кислот.

Непрямые методы

Серологические реакции - это методы лабораторной диагностики, базирующиеся на обнаружении антител (сокращенно АТ) к антигенам бледной трепонемы (сокращенно АГ). Они имеют основное значение для подтверждения диагноза.

  1. 1Нетрепонемные тесты:
    • Реакция Вассермана (РСК);
    • Реакция микропреципитации (МР, РМП) и ее аналоги, которые приведены ниже;
    • Тест быстрых плазменных реагинов (RPR, РПР);
    • Тест с красным толуидином и сывороткой (TRUST);
    • Нетрепонемный тест Лаборатории исследования венерических болезней - VDRL.
  2. 2Трепонемные тесты:
    • Р-ция иммобилизации Treponema pallidum – РИБТ/РИТ;
    • Р-ция иммунофлюоресценции – РИФ, FTA (разведения сывороток РИФ-10, РИФ-200, РИФ-абс);
    • Р-ция пассивной гемагглютинации (РПГА, ТРПГА, TPHA);
    • Иммуноферментный анализ (ИФА, EIA);
    • Иммуноблоттинг.
Алгоритм серодиагностики сифилиса

Рисунок 1 - Алгоритм серодиагностики сифилиса

Гистоморфологические методы

Эти методы сводятся к выявлению особенностей гистоморфологии сифилитических проявлений. Внимание уделяется тонкостям строения твёрдого шанкра. Однако, дифференциальная диагностика инфекции с помощью гистологии весьма затруднительна. Гистоморфология используется с другими лабораторными и клиническими тестами.

Микроскопия Treponema pallidum в тёмном поле

Этот метод основывается на непосредственном обнаружении бледной трепонемы в исследуемом материале с помощью микроскопа и специальных приспособлений (чаще всего отделяемое эрозий и язв, реже спинномозговая жидкость и другие субстраты).

С помощью скарификации, соскоба, сдавливания с эрозий и язвенных дефектов получают экссудат, затем исследуют в микроскоп подготовленный препарат.

Обычно бледные трепонемы выявляют в препарате, полученном из шанкра, из очагов вторичного свежего, вторичного рецидивного сифилиса, а также пунктата лимфоузлов, плаценты.

Основанный на феномене свечения мелких частиц в тёмном поле при попадании луча света (феномен Тиндаля), метод прекрасно позволяет дифференцировать возбудителя сифилиса от других трепонем на основании морфологических отличий и отличий в способах передвижения бактерии.

Для микроскопии используют специальный темнопольный конденсор соответствующего оптического разрешения. Препарат получают способом раздавленной капли (каплю материала наносят на чистое обезжиренное предметное стекло и закрывают очень тонким покровным).

На покровное стекло капают иммерсионное масло. С помощью поворота тубуса и поворота увеличивающей линзы регулируют нужное освещение.

В тёмном поле микроскопа обнаруживаются клетки крови, эпителиальные клетки и сам возбудитель сифилиса. Бледная трепонема выглядит как спираль, очень тонкая, излучающая серебристый цвет, с плавными движениями.

Темнопольная микроскопия как метод визуализации бледной трепонемы в исследуемом материале

Рисунок 2 - Темнопольная микроскопия как способ визуализации бледной трепонемы в исследуемом материале. Источник иллюстрации - CDC

Treponema pallidum необходимо отличать от других трепонем, в том числе и Tr. refringens, которая может содержаться в ротоглотке и на слизистой половых органов. Эта бактерия совершает хаотичные движения, имеет широкие и несимметричные, довольно грубые завитки. Кроме того, Treponema pallidum отличают от Tr. Microdentium, Tr. Buccalis и Tr. vincenti.

Визуализация бактерий в тёмном поле иногда дополняется реакцией флюоресценции. Для этого меченые флюоресцирующим красителем противотрепонемные АТ добавляют в нативный материал. При этом образуется комплекс, называемый антиген-антитело (сокращенно АГ-АТ), который и является объектом для исследования с помощью люминесцентного микроскопа.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ПЦР, разработанная в 1991 году для обнаружения молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) бледной трепонемы, является высокочувствительным и специфичным, позволяет выявить фрагменты ДНК возбудителя.

Базируется данный анализ на копировании коротких участков ДНК бледной спирохеты, который удовлетворяет заданным параметрам и присутствует в образце. Всё это выполняется в искусственных условиях (in vitro). Реакция проводится в приборе - амплификаторе, который обеспечивает периодизацию температурных циклов. Происходит охлаждение с последующим нагреванием пробирок с погрешностью в 0,1˚С.

ДНК-матрицу прогревают в течение 2 минут при температуре 92-98˚С (максимальная температура используется, если полимераза термостабильна). При нагревании цепи ДНК расходятся из-за распада водородных связей между ними. В стадии отжига температуру реакции снижают для связывания праймера с одноцепочечной матрицей.

Отжиг занимает около 30 секунд, в течение этого времени синтезируются сотни нуклеотидов. Вновь синтезируемые молекулы копируются полимеразой, в результате многократно увеличиваются специфические фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. Последующая детекция фрагментов проводится с помощью электрофореза в геле агар.

ПЦР-диагностика сифилиса пока носит экспериментальный характер, но оправдана при выявлении врождённой инфекции, в сложных диагностических случаях или при минимальном содержании бледных трепонем в исследуемом материале.

ДНК-гибридизация

ДНК-гибридизация выполняется in vitro и основана на полном или частичном соединении двух одноцепочечных молекул ДНК в одну молекулу. В случае полного соответствия комплементарных фрагментов объединение происходит легко. Если комплементарное соответствие частичное, то объединение цепочек ДНК происходит медленно. На основании времени слияния цепей можно оценить степень комплементарности.

При нагреве ДНК в буферном растворе разрываются водородные связи азотистыми основаниями, являющимися комплементарными, в результате цепочки ДНК расходятся. Далее получают препарат из двух денатурированных дезоксирибонуклеиновых кислот. При охлаждении одноцепочечные участки ренатурируют. Образуется так называемый гибрид ДНК.

Метод позволяет оценить и анализировать скорость отжига, учитывая особенности (сходства и различия) ДНК между видами или внутри вида.

Применение ДНК-зонда заключается в гибридизации меченого фрагмента ДНК со специфичным участком ДНК для идентификации комплементарных последовательностей нуклеотидов. Для метки зонда используется группа ненасыщенных атомов (хромофоры) или радиоактивные изотопы.

ДНК–зонд применяют для гетерогенного и гомогенного детектирования нуклеиновых кислот. Роль зонда заключается в определении участков, на которых произошло слияние мишень-зонд. Детектирование в гомогенной системе имеет преимущество - позволяет отследить гибридизацию молекул ДНК в реальном времени.

Суть метода сводится в денатурации ДНК и ренатурации (воссоединения цепочек ДНК). Процесс ренатурации нуклеиновой кислоты и ДНК-зонда заканчивается образованием «гибрида».

Специфические последовательности нуклеиновых кислот гибридизуются с ДНК–зондом и, таким образом, выявляются и позволяют оценить количество ДНК в исследуемом материале.

Заражение лабораторных животных

Высокая чувствительность кроликов к Treponema pallidum (порядка 99,9%) позволяет применять их в диагностике сифилитической инфекции.

Заражение кроликов проводится в научно-исследовательских центрах и является «золотым стандартом» оценки чувствительности других методов.

Вернёмся к трепонемным и нетрепонемным тестам, так как они используются чаще всего. Рассмотрим их преимущества и недостатки, а также ошибки в интерпретации результатов.

Нетрепонемные тесты

Это тесты определения антител IgG и IgM к стандартизированному кардиолипиновому антигену. Их существенным недостатком является сравнительно небольшая специфичность.

Низкая стоимость и простота выполнения позволяют отнести эти тесты к отборочным диагностическим, необходимым для установки предварительного диагноза и скрининга среди населения.

Именно нетрепонемные тесты сдаются при оформлении медицинской книжки, устройстве на работу, постановке на учет в женской консультации.

Недостатки:

  1. 1Минимальная чувствительность в стадии сифилиса первичного – 70%;
  2. 2Минимальная чувствительность в стадии сифилиса позднего – 30%;
  3. 3Возможность появления ложноотрицательных и ложноположительных результатов;
  4. 4Трудоёмкость выполнения РСК.

Преимущества:

  1. 1Относительно маленькая стоимость производства тестов;
  2. 2Получение быстрого ответа;
  3. 3Возможность их применения для скрининга.

Получение ложноположительных или слабоположительных проб возможно в следующих случаях:

  1. 1Нарушение технологии выполнения, при блокировании комплекса АГ-АТ.
  2. 2Наличие у больного аутоиммунных заболеваний (ревматоидный артирит, ревматизм, склеродермия, системная красная волчанка, саркоидоз и др.).
  3. 3Злокачественные новообразования.
  4. 4Вирусные и бактериальные инфекции.
  5. 5Эндокринные заболевания (аутоиммунный тиреоидит, сахарный диабет).
  6. 6Беременность.
  7. 7Употребление алкоголя.
  8. 8Приём жирной пищи.
  9. 9Старческий возраст.

Как видно из списка, существует достаточно  причин для неверного результата. Поэтому к нему следует весьма настороженно относиться. Рассмотрим наряду с РСК ещё две пробы. Это реакция микропреципитации и VDLR (ее модификация).

Реакция связывания комплемента (РСК, Вассермана, RW)

Это проба, основанная на способности комплемента связываться с комплексами АГ-АТ. Идентифицируют образовавшийся комплекс с помощью гемолитической системы. Кардиолипиновый антиген заметно повышает чувствительность пробы.

Чувствительной является и реакция Колмера, которая заключается в выполнении при различных температурных режимах. Так, первая фаза реакции Колмера протекает при температуре 20˚С в течение получаса, вторая фаза при тепературе 4-8˚С на протяжении 20-ти часов. За это время происходит связывание комплемента.

При выполнении РСК возможно получение резко положительных результатов. Причиной, вероятно, является большой титр антител в неразведенной сыворотке. В этом случае пробы ставят с уменьшающими дозами.

Для дифференцировки стадий сифилиса и оценки эффективности противосифилитического лечения определяют количество АТ в сыворотке.

Позитивность пробы оценивают с помощью крестов, также в реакциях Вассермана, Колмера и Канна указывается разведение сыворотки.

Реакция микропреципитации

Так как трудоёмкость выполнения вышеуказанных проб велика, то для широты обхвата диспансеризацией разных групп населения разработан ускоренный способ серодиагностики сифилиса, так называемый экспресс-метод – реакция микропреципитации (сокращенно МР, РМП).

Она выполняется с кардиолипиновым антигеном и вспомогательными веществами. Его преимуществом является забор периферической крови для исследования. Это значительно ускоряет и саму методику, и работу лаборантов.

Реакция микропреципитации (схема)

Рисунок 2 - Реакция микропреципитации (схема)

Для проведения МР необходимы плазма или инактивированная сыворотка крови пациента (именно они содержат антитела). Далее плазму помещают в маркированные лунки. Затем, к исследуемому материалу добавляют каплю кардиолипинового антигена, смешивают и встряхивают. В итоге в сыворотке инфицированного появляются характерные хлопья, разные по степени интенсивности.

Это качественная проба. При количественной оценке используются 10 разведений сыворотки, помещаемой в 10 лунок с соответствующей маркировкой. При качественной МР ответ указывается в виде крестов (плюсов) или минуса, при количественной указывается титр антител (1:2, 1:4 и так далее).

Наличие хлопьев расценивается как положительный или слабоположительный ответ. Возможно появление флокулята и при отсутствии заболевания, поэтому окончательную оценку полученного результата проводят после контрольного исследования или проведения других реакций (РИБТ, РИФ, ИФА, РПГА).

VDRL

Рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения метод постановки реакции с антигеном липоидной природы (АГ) по праву считается лучшим среди других стандартных нетрепонемных тестов. Разработан в США, штате Джорджиа в лаборатории венерических болезней (Veneral Diseases Research Laboratories).

Аббревиатура учреждения послужила названием для пробы – VDRL. VDRL - это модификация МР. Сыворотку от больного сифилисом инактивируют и помещают на предметное стекло. Используемый антиген состоит из кардиолипина, холестерина и лецитина в разном процентном соотношении. Ответ регистрируется практически сразу.

Отчётливая флокуляция возникает в присутствии в сыворотке антител. Сыворотка становится реактивна по прошествии 4-х недель после заражения. Для оценки количества антител, сыворотку предварительно разводят в геометрической прогрессии.

Преимущества VDRL:

  1. 1сравнительно высокая чувствительность;
  2. 2сравнительно высокая специфичность;
  3. 3легкость выполнения;
  4. 4малая стоимость реактивов;
  5. 5получение быстрого ответа.

Недостатком VDRL является относительно высокая частота ложноположительных результатов.

Их причинами являются всё те же перечисленные выше заболевания.

Трепонемные тесты исполняются со специфическими АГ Treponema pallidum. Они необходимы и обязательны для установления окончательного диагноза. Это реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакции непрямой гемагглютинации (РПГА), иммуноферментный анализ (ИФА) и др.

После положительного результата нетрепонемного теста (RPR, MP, VDRL) всегда должны выполняться трепонемные (чаще комбинация - РПГА, ИФА, РИФ).

Трепонемные тесты более сложны в исполнении, чем экспресс-тесты, и требуют больших затрат денежных средств.

РИФ

Данная реакция (сокращенно РИФ) используется для диагностики сифилиса, в том числе и скрытых форм, и перепроверки положительных и ложноположительных проб.

РИФ основана на свечении меченых антител при соединении с комплексом антиген-антитело под кварцевой лампой. Метод начал применяться в 60-х годах и отличался простотой выполнения и высокой специфичностью (которая немного уступает РИБТ).

Он имеет несколько модификаций: РИФ-10, РИФ-200 и РИФ-abs.

Наиболее чувствительна РИФ в разведении 10 раз, а остальные - более специфичны. РИФ проводится в двух фазах. К АГ добавляют сыворотку крови пациента. Образуется комплекс АГ-АТ, который исследуется в следующей фазе. Далее меченный с помощью флюоохрома комплекс идентифицируют при микроскопии. Если не наблюдается свечение, это указывает на отсутствие специфических АТ в сыворотке крови.

РИФ-200 является наиболее ценным из всех разведений. Метод предназначен для диагностики различных форм сифилиса, особенно скрытого сифилиса и перепроверки положительных проб.

РИБТ

Реакция иммобилизации бледных трепонем (сокращено РИБТ, РИТ) одна из сложных серологических проб, требующих значительных усилий и финансовых затрат. РИБТ применяют все реже, но актуальность ее сохраняется в диагностике скрытого сифилиса.

Большое значение она несёт в распознавании ложноположительных результатов у беременных женщин и основывается на иммобилизации бактерий в присутствии иммобилизинов – поздних антител.

Результат оценивается на процентном количестве (%) иммобилизированных трепонем с помощью специальной таблицы:

  1. 1От 0 до 20 - отрицательная проба.
  2. 2От 21 до 50 - слабоположительная проба.
  3. 3От 50 до 100 - положительная реакция.

Ложноположительные результаты также возможны при применении РИБТ. Так, неверный ответ возможен при инфицировании тропическими трепанематозами, а также, при туберкулёзе, циррозе печени, саркоидозе и пациентов старческого возраста.

РПГА

Этот анализ крови на сифилис называется реакцией пассивной гемагглютинации (сокращенно, кровь на РПГА, ТРПГА).

Антиген для РПГА приготавливают из эритроцитов барана, покрытых фрагментами бледных трепонем (полученных от инфицированных кроликов (см. рисунок 4)). Для анализа используется венозная кровь (плазма или инактивированная сыворотка) пациента.

При добавлении антигена в сыворотку пациента с сифилисом происходит образование комплекса АГ-АТ, который приводит к агглютинации эритроцитов. агглютинация определяется субъективно врачом-лаборантом.

Схема РПГА (реакция пассивной гемагглютинации)

Рисунок 3 - Схема РПГА (реакция пассивной гемагглютинации)

Проба оценивается как положительная при появлении агглютинатов равномерной розовой окраски. Окрашивание преципитата в красный свидетельствует об осаждении эритроцитов. РПГА является высокочувствительной и высокоспецифичной.

Реакция микрогемагглютинации

Она является упрощённым вариантом РПГА. Отличается от пробы, описанной выше, меньшим количеством антигена, разбавителя и сыворотки крови для выполнения реакции. Через 4 часа после инкубации сыворотки можно оценить пробу. Используется при скрининговых и массовых обследованиях на сифилис.

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (сокращенно ИФА) базируется на специфической реакции антиген-антитело. Биологический материал (сыворотка крови пациента, ликвор) вносят в лунки, на твердой поверхности которых фиксированы антигены бледной трепонемы. Исследуемый материал инкубируют, затем отмывают антитела, не связавшиеся с антигенами (см. рисунок 5).

Идентификация полученного комплекса осуществляется на этапе ферментации с помощью иммунной сыворотки, меченной ферментом. При химической реакции фермент окрашивает полученные комплексы. Интенсивность окрашивания зависит от количества специфических антител в крови пациента и фиксируется спектрофотометром.

Схема ИФА (иммуноферментного анализа)

Рисунок 4 - Схема ИФА (иммуноферментного анализа)

Чувствительность ИФА составляет более 95% . Метод используется в автоматизированном режиме для исследования декретируемых групп населения: доноров, беременных и других, для уточнения диагноза при положительных и ложноположительных нетрепонемных тестах.

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг – высокочувствительный метод, модификация простого ИФА. Реакция основана на электрофорезе с разделением антигенов бледных трепонем.

Разделенные иммунодетерминанты переносят на нитроцеллюлозную бумагу и проявляют в ИФА. Далее инкубируют сыворотку и смывают не связавшиеся антитела. Полученный материал обрабатывают иммуноглобулинами (IgМ или IgG), меченными ферментом.

Клиническая оценка результатов лабораторной диагностики сифилиса

В таблице 1 ниже мы привели возможные результаты анализов и их расшифровку. Как можно видеть в таблице, основное значение при расшифровке имеет комплексная оценка тестов.

Расшифровка результатов серологических реакций на сифилис

Таблица 1 - Расшифровка результатов серологических реакций (анализов крови на сифилис). Для просмотра кликните по таблице

Оценка реактивности тестов выполняется также «крестами»:

  1. 1Максимальный ответ (резко положительная проба) обозначается с помощью 4-х крестов.
  2. 2Положительная проба обозначается с помощью 3-х крестов.
  3. 3Слабоположительную реакцию обозначают двумя крестами.
  4. 4Один крест свидетельствует о сомнительном и отрицательном результате.
  5. 5Отрицательный ответ маркируют знаком «минус».

Проблема оптимизации лабораторной диагностики сифилиса не потеряла свою актуальность до настоящего времени. Современные методы диагностики, несмотря на стремление учёных привести диагностику к максимально высоким показателям чувствительности и специфичности, требуют контрольной проверки и индивидуального подхода.

Особенностью сифилитической инфекции является феномен серорезистентности, который так и не получил научного объяснения. Диагноз выставляется после полноценного обследования больного эпидемиологическими, клиническими, лабораторными методами.

На фоне экономико-технического развития медицины наблюдается и прогресс в разработке новых критериев диагностики сифилиса. Всё это позволит быстро, успешно и безошибочно лечить пациентов.