Микрофлора влагалища

К изменениям биоценоза влагалища приводят такие факторы, как:

  1. 1Гормональный статус женщины;
  2. 2Возраст;
  3. 3Образ жизни, характер питания;
  4. 4Половое поведение и смена полового партнера;
  5. 5Способ предохранения;
  6. 6Иммунный статус;
  7. 7Акушерско-гинекологический анамнез;
  8. 8Реализация репродуктивной функции;
  9. 9Прием лекарственных средств (гормональных, антибактериальных);
  10. 10Экстрагенитальная патология.

Все эти факторы так или иначе сказываются на составе влагалищной флоры женщины, при нарушении ее баланса возможно развитие гинекологических заболеваний.

Важен не столько качественный, сколько количественный состав микробиоты (особенно для факультативной флоры).

В ходе исследований в рамках проекта "Микробиом человека" (2012г., США) была доказана ведущая роль не только состояния равновесия микрофлоры урогенитального такта, но и дисбиотических нарушений в реализации репродуктивной функции и качества жизни женщины в целом.

Было исследовано и доказано влияние инфекций урогенитального тракта, дисбиотических процессов в этиологии самопроизвольных выкидышей, преждевременных родов, , внутриутробного инфицирования и патологий развития плода, бесплодия, привычного невынашивания беременности.

Одним из самых информативных анализов в работе акушер-гинеколога является исследование состава влагалищной флоры, как качественного, так и количественного.

Один из рутинных и самых недорогих методов – это микроскопия мазка. Как бы не был хорош этот метод, он имеет ряд недостатков:

  1. 1Человеческий фактор. Оценка мазка осуществляется лаборантом, поэтому результат мазка на флору зависит от опытности и квалификации персонала лаборатории.
  2. 2Не всегда есть гарантия правильности забора мазка, иногда не получается захватить достаточное количество патогенной флоры.
  3. 3При микроскопии обнаруживаются не все инфекционные агенты (например, при простой микроскопии не видны уреаплазмы, микоплазмы, хламидии). Для их обнаружения необходимы дополнительные исследования, что затягивает постановку диагноза.

В настоящее время в РФ разработана специальная система для оценки влагалищной флоры методом ПЦР «здесь и сейчас» – тест-система «Фемофлор». Этот метод широко используется в амбулаторных условиях.

История возникновения

Система Фемофлор разработана и апробирована в 2008-2009 годах компанией «ДНК-Технологии» в России. Главная ее задача – исследование состава микрофлоры урогенитального тракта женщин.

В 2014 году данная разработка признана победителем премии «Призвание». На данный момент метод широко используюется в акушерско-гинекологической практике, включен в список оказания высокотехнологичной помощи по профилю «Акушерство и гинекология».

Что такое Фемофлор?

Фемофлор - это тест-система для определения количественного и качественного состава влагалищной флоры методом обнаружения ДНК бактерий, увеличения их количества и идентификации в пределах реального времени.

Фемофлор позволяет:

  1. 1Определить общую бактериальную массу.
  2. 2Дать количественную оценку нормофлоры.
  3. 3Дать количественную оценку факультативной флоры, ее корреляцию с общим составом бактерий.
  4. 4Выполнить контроль забора материала для исследования.

Биохимические основы

В основе проведения анализа с помощью набора реагентов «Фемофлор» лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР) с амплификацией (увеличение количества копий) ДНК.

Любая элементарная ПЦР состоит из следующих этапов:

  1. 1Расплетение нитей ДНК.
  2. 2Отжиг – то есть присоединение коротких нитей ДНК-затравок (праймеров), которые необходимы для дальнейшего образования нуклеиновых кислот.
  3. 3Комплементарное достраивание новых нитей – образование новой цепи ДНК.

Для успешного проведения ПЦР-диагностики необходимы следующие материалы:

  1. 1ДНК-матрица, то есть участок, подлежащий амплификации;
  2. 2Два комплементарных праймера (затравки);
  3. 3ДНК-полимераза термостабильная – фермент, необходимый для катализа реакции полимеризации;
  4. 4Дезоксирибонуклеофосфаты – строительный материал;
  5. 5Соли магния – для работы ДНК-полимеразы;
  6. 6Буферный раствор.

Проще говоря, не важно сколько исследуемого материала было взято. Даже минимальное его количество будет увеличено в количестве и идентифицировано.

Наборы реагентов

Набор реагентов «Фемофлор» состоит из:

  • Комплекс для обнаружения общего количества бактерий;
  • Комплекс для обнаружения состава и количества нормофлоры (Lactobacillus spp.);
  • Комплекс для обнаружения состава и количества факультативной флоры (состав зависит от комплектации Фемофлор-16 (17), Фемофлор-8 (9), Фемофлор-4, Фемофлор Скрин).

С помощью набора «Фемофлор» можно проконтролировать правильность течения процесса с помощью контрольной пробирки, а также правильность забора материала с помощью пробирки с комплексом для обнаружения генома человеческой ДНК.

В каждую реакционную смесь системы Фемофлор введены специальные ДНК-зонды, несущие в себе флуоресцентную составляющую (метку) в сочетании с гасителем флуоресценции.

Действие гасителя прекращается при наличии специфических продуктов разрушения ДНК-зонда, после чего возникает флуоресценция. Чем больше этих специфических ампликонов, тем ярче будет свечение (флуоресценция).

Чтобы увеличить специфичность и чувствительность реакции, применяют метод «горячего» старта. При этом реакционная смесь разделена на 2 прослойки с помощью парафина. Слои смешиваются и превращаются в реакционную смесь только при плавлении парафина в детекторе, исключая неспецифический отжиг праймеров.

Преимущества и недостатки метода

Чувствительность метода при оценке дисбиотических нарушений составляет 88%, а специфичность – 89%. При диагностике бактериального вагиноза чувствительность Фемофлора выше и достигает порядка 95%.

Таким образом, основным преимуществом тест-системы Фемофлор является его достаточная чувствительность и специфичность в отношении ведущих патогенов урогенитальной сферы женщины, независимо от их видовой принадлежности (бактерии, грибы, вирусы, простейшие).

К плюсам метода можно отнести:

  1. 1Быстроту и простоту исполнения;
  2. 2Минимальную зависимость от человеческого фактора, имеющийся контроль правильности взятия мазка;
  3. 3Возможность оценки количества и качества факультативной и нормальной флоры, возможность оценки соотношения между разными видами микроорганизмов;
  4. 4Одновременное обнаружение различных возбудителей (бактерий, простейших, вирусов, грибов);
  5. 5Отсутствие противопоказаний к назначению данного метода.

Недостатки метода:

  1. 1Стоимость метода. Фемофлор не входит в список бесплатно оказываемых услуг (за исключением программы высокотехнологической медицинской помощи), что зачастую останавливает пациентку от выполнения анализа.
  2. 2Перед сдачей анализа появляется необходимость в соблюдении ряда условий (например, необходимо исключить незащищенные половые контакты за 48-72 часа до сдачи анализа).

Какие микроорганизмы можно обнаружить с помощью анализа?

  1. 1Lactobacillus spp. – нормальная флора влагалища, грамположительные факультативно анаэробные или микроаэрофильные палочки. Во влагалище продуцируют молочную кислоту, чем обеспечивают кислую среду и поддержание местного иммунитета.
  2. 2Enterobacterium spp. – грамотрицательные споронеобразующие палочки, представители факультативных анаэробов.
  3. 3Streptococcus spp. – грамположительные бактерии округлой формы, располагающиеся цепочкой, относящиеся к факультативным анаэробам.
  4. 4Staphylococcus spp. – грамположительные бактерии круглой формы, факультативные анаэробы.
  5. 5Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp. – бактерии, зачастую ответственные за развитие бактериального вагиноза, факультативные анаэробы.
  6. 6Eubacterium spp. – одноклеточные бактерии самой различной формы (от овоидной до звездчатой).
  7. 7Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp. – грамотрицательные споронеобразующие анаэробные бактерии, представители факультативной флоры.
  8. 8Megasphaera spp./Veilonella spp./Dialister spp. – грамотрицательные споронеобразующие кокковидные анаэробные бактерии.
  9. 9Lachnobacterium spp./Clostridium spp. – грамположительные, палочки, способные продуцировать эндоспоры, представители облигатных анаэробов.
  10. 10Mobyluncus spp./Corynebacterium spp. – грамположительные палосковидные, вибрионовидные бактерии, облигатные анаэробы.
  11. 11Peptostreptococcus spp. – факультативные грамположительные анаэробные кокки.
  12. 12Atopobium vaginae – грамположительные анаэробные палочки, маркер бактериального вагиноза.
  13. 13Mycoplasma genitalium+hominis – микроорганизмы без клеточной стенки, внутриклеточный паразит. Mycoplasma genitalium в норме отсутствуют в организме женщины.
  14. 14Ureaplasma (urealyticum + parvum) – внутриклеточный паразит, без клеточной стенки, может в норме обнаруживаться во влагалищной биоте у женщины.
  15. 15Candida spp. – диплоидный дрожжеподобный грибок, возбудитель вагинального кандидоза.

В зависимости от комплектации различают несколько видов теста Фемофлор (см. таблицу ниже).

Виды анализа Фемофлор

Таблица 1 - Виды анализа Фемофлор: Фемофлор 4, Фемофлор 8 (Фемофлор 9), Фемофлор 16 (Фемофлор 17)

Оценка и расшифровка результатов

Оценка общей обсемененности

Оценивается общее количество бактерий в исследуемом материале – общая бактериальная масса. Нормальные ее значения колеблются в пределах 108-10ГЭ/образец.

Снижение этого показателя ниже 10чаще всего свидетельствует о проведенном курсе лечения (применение антибиотиков и антисептиков). Повторить такой анализ рекомендуется через 14 дней.

Снижение показателя у женщин в перименопаузе или постменопаузе является доказательством атрофических процессов.

Исследование нормофлоры влагалища

В идеале нормальная флора женщины представлена микроорганизмами Lactobacillus spp, их количество равно общей бактериальной массе, то есть 108-10ГЭ/образец.

В ходе анализа проводится корреляция общего количества бактериальной массы, лактобацилл и доли факультативной флоры.

При нормоценозе доля лактобацилл составляет не менее 95%. Снижение ее до 80% говорит о умеренном дисбиозе, а до 20% - о крайне выраженном нарушении состава флоры.

Исследование состава факультативной флоры

При выявлении нарушений биоценоза необходимо анализировать превалирующую долю сопутствующей флоры.

Если преобладает факультативно-анаэробная флора, то дисбиоз расценивается как аэробный, если облигатно-анаэробная – то как анаэробный.

При одинаковом их соотношении говорят о смешанной этиологии.

Нормальные значения влагалищной микрофлоры в зависимости от вида микроорганизма

Таблица 2 - Нормальные значения влагалищной микрофлоры в зависимости от вида микроорганизма

Патогенная флора, выявляемая при выполнении Фемофлор Скрин

Таблица 3 - Патогенная флора, выявляемая при выполнении Фемофлор Скрин. Для просмотра кликните по таблице

Показания к проведению анализа

В целом ограничений к назначению исследования влагалищного мазка нет.

Но чаще всего Фемофлор назначают для:

  1. 1Идентификации возбудителя при инфекционном процессе (появление патологических белей, их неприятный запах) и назначения адекватной этиотропной терапии.
  2. 2Изучения состава влагалищной флоры, ее качественной и количественной составляющих.
  3. 3Постановки диагноза при расхождении клинических и лабораторных данных.
  4. 4Скрининга при беременности (во всех триместрах).
  5. 5Скрининга при предгравидарной подготовке.
  6. 6В качестве дополнения к микроскопическому исследованию для оценки состояния биоценоза здоровых женщин.
  7. 7Подтверждения диагноза «бактериальный вагиноз» с определением факультативной флоры с патологическим характером роста.
  8. 8Контроля эффективности терапии.
  9. 9Мониторинга восстановления нормальной флоры.

Противопоказаний к проведению анализа нет. Единственным условием является правильное выполнение забора и транспортировки исследуемого материала.

Для уточнения этиологии гинекологических заболеваний иногда необходимо дополнительно анализировать наличие абсолютных патогенов (хламидии, гонококки, трихомонады) с помощью метода ПЦР.

Наличие данных микроорганизмов исследуется в формате реактивов «Фемофлор Скрин», куда дополнительно входит определение:

  1. 1Neisseria gonorrhoeae
  2. 2Herpesvirus 1
  3. 3Chlamydia trachomatis
  4. 4Trichomonas vaginalis
  5. 5Citomegalovirus
  6. 6Herpesvirus 2

Когда и какой Фемофлор назначается, рассмотрим ниже.

Фемофлор 4

Проводится оценка общего состояния биоценоза. Целесообразно применять при симптомокомплексах вульвовагинального кандидоза, бактериального вагиноза, либо с целью оценки эффективности проведенной терапии.

Фемофлор 8 (Фемофлор 9)

Проводится более расширенная оценка состояния биоценоза. Также применяют при симптомах кандидоза, бактериального вагиноза, а также с целью оценки качества проведенных лечебных мероприятий, неспецифического вагинита.

Фемофлор 16 (Фемофлор 17)

Детально анализируется состав флоры. Назначается при хронических рецидивирующих инфекционных процессах, при предгравидарной подготовке, подготовке к операциям, гистероскопии, ЭКО, введению ВМС, а также для оценки качества проведенной терапии.

Фемофлор Скрин

Дополнительно анализируется наличие специфической инфекции и вирусов. Назначается при явлениях специфической инфекции (гонорея, трихомониаз), генитальном герпесе, вторичном бесплодии, наличии спаечных процессов в малом тазу, патологии беременности, при предгравидарной подготовке, хронических кольпитах и цервицитах.

Правила забора и транспортировки материала

Для исследования необходимо взятие соскоба из задне-бокового свода влагалища, цервикального канала или уретры.

До забора предварительно следует ознакомить женщину с некоторыми нюансами подготовки к исследованию:

  1. 1Необходимо закончить курс терапии антибактериальными препаратами за 14 дней до исследования;
  2. 2Необходимо закончить курс терапии эубиотиками и пробиотиками за 14 дней до исследования;
  3. 3Исключить защищенные половые контакты непосредственно перед исследованием, незащищенные – за 48 часов до взятия соскоба;
  4. 4Исключить применение тампонов за сутки до забора материала;
  5. 5Выждать 48-часовой промежуток после кольпоскопии и трансвагинального УЗИ.

Забор из заднебокового свода

Перед осуществлением забора женщина НЕ должна проводить гигиенические процедуры и спринцевания, вводить лекарственные и антисептические свечи.

Материал представляет собой соскоб эпителиальных клеток. Чаще всего забор из заднебокового свода берется для оценки биоценоза влагалища.

Производится во время осмотра влагалища в зеркалах, строго ДО мануального исследования. Важным условием является отсутствие патологической слизи, крови из места забора, при необходимости – их механическое удаление стерильным ватным тампоном. При неправильном взятии соскоба и результат анализа будет недостоверным.

Соскоб берут специальным одноразовым зондом, который затем помещают в пробирку с питательной средой (1,5 мл «Эппендорф» с питательной средой), тщательно его прополаскивают в среде, затем зонд утилизируют.

Пробирку обязательно маркируют и плотно закрывают крышкой.

Забор из цервикального канала

Обычно проводится при подозрении на патологию шейки матки (цервицит). Если патологический процесс виден в зеркалах, то рекомендуется брать материал именно из этого участка.

Важным условием забора является отсутствие посторонних примесей и слизи, которые можно ликвидировать простерилизованным ватным тампоном, после чего шейка обрабатывается стерильным раствором 0,9% натрия хлорида.

В цервикальный канал вводят специальный зонд на глубину не более 1,5 см, круговым движением очерчивается полный круг, после этого зонд извлекается. На данном этапе важно не задеть стенки влагалища (результат может быть недостоверным).

Забор отделяемого мочеиспускательного канала

Перед взятием мазка из уретры пациентке рекомендуют выждать 1,5-2 часовой перерыв после последнего мочеиспускания.

Уретру, а точнее ее наружное отверстие, предварительно смачивают стерильным раствором 0,9% раствором натрия хлорида, после этого можно производить забор материала.

Если у пациентки имеются обильные специфические (гнойные или слизистые) выделения, двухчасовой интервал между последним мочеиспусканием и временем забора материала можно не соблюдать.

Зонд вводится на глубину 1-1,5 см одним движением, а затем извлекается без каких-либо дополнительных манипуляций.

После забора материала для исследования пробирка маркируется, к ней прикрепляется направление, в котором указывается предварительный диагноз, дату последней менструации или причину ее отсутствия (менопауза, аменорея).

Транспортировка осуществляется специально обученным лаборантом. Допускается замораживание материала при температуре -20 С на срок не более 1 месяца.